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PP2对人胆管癌细胞株的影响

 论文栏目:癌细胞论文     更新时间:2015/8/9 9:35:46   

1材料与方法

1.1实验材料

人胆管癌QBC939细胞株由解放军医学院实验室提供;采用RPMI1640培养液、FCS胎牛血清、P-S双抗青霉素-链霉素美国(GIBCO公司)进行细胞培养,使用时按89:10:1比例配制成完全1640培养液做工作液;细胞培养板(美国Costar公司);Src激酶特异性抑制剂PP2(Sigma公司,美国);兔抗人磷酸化Src单克隆抗体(Tyr416,Millipore公司);鼠抗人β-actin单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司);Transwell侵袭小室(8pm孔径)(Millipore公司);细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(碧云天生物技术研究所);mRNA试剂盒(QIAGEN公司);cDNA逆转录试剂盒(Thermo公司);RT-PCR试剂盒(罗氏公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及实验分组人胆管癌QBC939细胞用含10%胎牛血清和P-S双抗的RPMI1640培养液,置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内进行培养;常规更换培养液,利用胰酶对细胞消化传代,实验采用处于对数生长期的细胞。实验共设四组,即空白对照组、实验A组、实验B组、实验C组(分别用2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L的Src激酶特异性抑制剂PP2处理)。

1.2.2PP2溶液配制Src激酶特异性抑制剂PP2溶解度为20mg/mL,利用DMSO作为溶剂,配制PP2饱和溶液。用含10%胎牛血清的培养液稀释获得50μmol/L的PP2母液进行备用,使用时根据需要再稀释获得不同浓度的工作液进行实验操作。

1.2.3WesternBlotting检测PP2对QBC939细胞Src激酶磷酸化的影响取对数生长期的QBC939细胞分别用2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L浓度的PP2处理48h后,以BCA法测定细胞裂解后获取的蛋白含量。取80μgSDS-PAGE,至PVDF膜,5%脱脂奶粉进行非特异性抗原封闭,加入1:500Tyr416,1:200的β-actin作为内参对照,4℃过夜,用含0.1%Tween20TBS洗膜,加入1:1000带有辣根过氧化物酶标记的二抗,室温下反应1h,TBS洗膜后DAB显色并记录。

1.2.4人胆管癌QBC939细胞体外侵袭检测50mg/L基质胶按1:4稀释液包被8μm孔径Transwell小室滤膜的上表面,置于37℃5%CO2培养箱中温育1h,并用L-15水化小室滤膜上下表面。消化并收集细胞,离心去培养液。PBS洗2遍,用含0.1%BSA的L-15培养基重悬细胞,调整密度为1×105/mL细胞悬液。先在小室上层加入4组200μL细胞悬液,混匀后向下室加入600μL10%FBS的L-15培养液。将24孔板置于37℃无CO2培养箱中培养。48h后移出,置于4%多聚甲醛中固定30min,1%结晶紫染色10min,倒置显微镜观察,每组6个视野。实验重复三次。

1.2.5PCR检测mRNA表达取对数生长期的人胆管癌QBC939细胞经PP2处理48h,收集细胞,提RNA,逆转录为cDNA,取各组cDNA,用ddH2O稀释50倍。按要求加入试剂cDNA,正义引物,反义引物和ROX。设定循环:50℃2min,95℃10min,95℃15s,60℃1min,95℃15s,60℃30s,95℃15s。

1.2.6WesternBlotting检测PP2对QBC939细胞侵袭相关分子蛋白表达的影响取对数生长期的人胆管癌QBC939细胞经PP2处理48小时后,收集细胞并对其进行裂解,提取细胞总蛋白,以BCA法测定细胞裂解蛋白含量。吸取定量后的80μg蛋白质,12%SDS-PAGE法进行分离后,转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原,分别加入稀释后的鼠抗人E-cad-herin和CD44一抗,鼠抗人β-actin单克隆抗体进行1:200稀释作为内参对照,4℃反应过夜后,用含0.1%Tween20的TBS洗膜,加入二抗,室温下反应1h,DAB显色并记录结果。

1.3统计学方法

研究数据汇总后采用SPSSl7.0统计软件进行统计分析,收集数据以mean±SD表示,数据经过正态性检验资料,多组间整体比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法及HSD法,显著性水准均取α=0.05。

2结果

实验组p-Src蛋白表达水平明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组穿过小室的细胞数显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。经PP2处理后,实验组E-cadherinmRNA表达显著增强,而CD44mRNA表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.005)。实验组E-cadherin蛋白水平明显增高,而CD44蛋白水平则显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

肿瘤细胞侵袭是一个复杂的过程,随着细胞间粘附性降低,肿瘤细胞脱离其原发部位,散落至其他部位,形成转移灶[12]。研究显示,Src激酶在肺癌、宫颈癌等多种实体恶性肿瘤组织中被活化而过表达,活化后的Src激酶对其下游信号转导分子进行磷酸化,进而影响肿瘤细胞的侵袭能力[13]。PP2是一种pyrazolopyrimidine复合物,能够选择性抑制Src激酶家族,是Src激酶的特异性抑制剂[14]。本研究通过PP2抑制人胆管癌QBC939细胞中Src激酶,观察Src激酶抑制剂PP2对人胆管癌QBC939细胞侵袭能力的作用和机制。结果发现,人胆管癌QBC939细胞中Src激酶处于高活性状态,而用5μmol/L的Src激酶抑制剂PP2可显著抑制QBC939细胞中p-Src的表达(P<0.05)。此外,通过体外侵袭实验我们发现,Src激酶抑制剂PP2抑制QBC939细胞Src激酶的活化后,QBC939细胞的侵袭能力明显减弱(P<0.05)。结果表明,Src激酶抑制剂PP2能够抑制QBC939细胞中的Src激酶活性。这一结果与已有报道基本一致[15]。E-cadherin是广泛存在于组织的上皮细胞中的蛋白分子,对细胞的粘附聚集十分重要[16]。E-cadherin分子为肿瘤侵袭抑制分子,下调其表达后,肿瘤细胞的侵袭能力显著增强[17]。CD44分子则是与肿瘤预后密切相关的肿瘤促侵袭分子,当机体上调CD44的表达时,肿瘤细胞侵袭能力随即增强,肿瘤细胞更易进入血液及淋巴循环,导致肿瘤转移灶的产生[18]。本研究结果显示,Src激酶抑制剂PP2抑制Src激酶的活化后,E-cadherin分子mRNA水平和蛋白水平的表达显著增高(P<0.05),而CD44分子mRNA水平和蛋白水平的表达则明显降低(P<0.05)。结果证明,Src激酶抑制剂PP2抑制QBC939细胞中Src激酶的活化后,能上调肿瘤细胞侵袭抑制分子E-cadherin、下调肿瘤细胞促侵袭分子CD44mRNA水平,最终导致QBC939细胞侵袭能力减弱,而且5μmol/L抑制浓度为最佳。但是,PP2抑制Src激酶活化具体通过什么途径减弱肿瘤细胞的侵袭能力目前并不清楚,还需进一步研究证实。

综上所述,PP2能通过抑制Src激酶的活化显著抑制人胆管癌QBC939细胞的侵袭能力,机制可能是由于PP2抑制Src激酶活化后影响了肿瘤细胞侵袭抑制分子E-cadherin和促侵袭分子CD44的表达水平所致。这为胆管癌患者以Src激酶为治疗靶标的Src激酶特异性抑制剂抗肿瘤治疗策略的研发提供了实验依据。

作者:王大东 许勇 韩明明 窦春青 涂玉亮 朱自满 杨壮杰 金鑫 姜凯 杜楠 单位:解放军总医院第一附属医院

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